非洲豬瘟檢測(cè)瓶頸之核酸提取與純化
發(fā)布時(shí)間：2019-10-21 閱讀：325次
眼下，豬價(jià)高漲，政策加持，加上一年多的抗非歷練，讓很多養(yǎng)豬人從怦然心動(dòng)，到悄然行動(dòng)，開啟了復(fù)養(yǎng)之路。此刻，且不論非洲豬瘟威脅下的復(fù)養(yǎng)勝算幾何，如履薄冰的忐忑是一望而知的。面對(duì)非洲豬瘟，都說(shuō)“防非千萬(wàn)條，生物安全條”，除此之外，在抗擊非洲豬瘟的過(guò)程中，有的豬場(chǎng)消失了，而有的豬企趁勢(shì)崛起，個(gè)中經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)也值得反思。痛定思痛，目前有效的防控非洲豬瘟策略是什么？撥云見(jiàn)日之后，有哪些實(shí)用技術(shù)是切實(shí)可行的？
非洲豬瘟“化”以來(lái)，關(guān)于該病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)內(nèi)容的討論越來(lái)越多，取得的科技進(jìn)展也越來(lái)越大。從樣本的采集、運(yùn)輸、保存到核酸的提取、擴(kuò)增，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)大大降低非洲豬瘟病毒檢測(cè)工作的敏感性。在2018年8月份和2019年3月份之間，這種檢測(cè)敏感性較低的情況尤為突出。
唾液學(xué)檢測(cè)具有較高的生產(chǎn)現(xiàn)實(shí)意義，該方法已經(jīng)成為非洲豬瘟檢測(cè)工作的方法。血液學(xué)檢測(cè)過(guò)渡至唾液學(xué)檢測(cè)的過(guò)程中，同樣也出現(xiàn)了很多的問(wèn)題，這些問(wèn)題正在被逐步解決。
先是唾液中病毒核酸被干擾的問(wèn)題嚴(yán)重影響了唾液學(xué)檢測(cè)技術(shù)的推廣進(jìn)度。唾液中的活性酶會(huì)大大縮短樣本中目標(biāo)核酸的半衰期，導(dǎo)致漏檢率的居高不下，嚴(yán)重影響了定點(diǎn)清除（拔牙式清除）工作的效率。不過(guò)，隨著各個(gè)試劑公司推出唾液樣本保護(hù)液，該問(wèn)題已經(jīng)得到較好的解決。
根據(jù)近期實(shí)驗(yàn)室研究比對(duì)得到的情況，病毒核酸的提取和純化再次成為約束唾液學(xué)檢測(cè)的另外一個(gè)重要瓶頸，這個(gè)問(wèn)題如果不能及時(shí)得到解決將大大阻礙明年春季非洲豬瘟疫情的防控工作。
非洲豬瘟病毒大多數(shù)存在于細(xì)胞之內(nèi)，病毒核酸也被雙層囊膜和多層蛋白質(zhì)緊緊包裹，只有將病毒核酸徹底釋放并純化，才能實(shí)現(xiàn)核酸的有效擴(kuò)增。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中，尤其是唾液學(xué)檢測(cè)工作中，經(jīng)常性出現(xiàn)漏檢（假陰性）的情況，這些情況大大困擾了生產(chǎn)技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，嚴(yán)重制約了非洲豬瘟的定點(diǎn)清除工作和未來(lái)非洲豬瘟凈化工作的效果。
根據(jù)現(xiàn)代生物技術(shù)研究的進(jìn)展，病毒核酸的提取和純化總體上分成三步：核酸釋放、核酸純化和收集。
各個(gè)試劑公司出品的試劑盒具有相對(duì)的不完備性，往往通過(guò)增加繁瑣的步驟試圖完成核酸的提取和純化工作，但增加提取步驟會(huì)大大降低了核酸的得率。所以，簡(jiǎn)化操作過(guò)程將成為核酸提取和純化研究的要任務(wù)。
核酸釋放：組織細(xì)胞內(nèi)和病原體內(nèi)的核酸釋放可以通過(guò)反復(fù)凍融法、機(jī)械研磨法和化學(xué)裂解法進(jìn)行。無(wú)論采用哪一種方法，內(nèi)源性和外源性核酸酶都會(huì)降低核酸的得率。實(shí)際操作中往往通過(guò)采用較低的溫度條件、快速的機(jī)械研磨或加核酸酶抑制劑等方法避免核酸酶的降解作用。
核酸純化：裂解后的液體中除了含有核酸成分以外，還有大量的雜質(zhì)，如蛋白、多糖以及其它化學(xué)物質(zhì)。這些雜質(zhì)不除去，可能會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的核酸擴(kuò)增。核酸純化的常見(jiàn)方法有酚-氯仿法、膜吸附法和磁珠吸附法。由于使用了有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，酚-氯仿法基本上已經(jīng)被棄用，而采用吸附法純化核酸將成為未來(lái)的主流。
收集：核酸的收集比較簡(jiǎn)單，吸附在膜上或磁珠上的核酸可以用純水洗脫。但是，為了提高核酸得率并保護(hù)核酸，可以用特殊的溶液進(jìn)行洗脫。
EDTA會(huì)抑制后續(xù)的分子生物學(xué)反應(yīng)，不建議使用TE進(jìn)行核酸洗脫。
核酸提取與純化（柱提法）的商品化套裝應(yīng)該包括：裂解液1瓶（建議使用棕色瓶，裂解液中要求包含助吸附成分（Binding buffer），減少操作步驟），清洗液1瓶（建議使用白色瓶，使用前加入適量無(wú)水乙醇或異丙醇），洗脫液1瓶，吸附柱（若干），簡(jiǎn)易說(shuō)明書（1份）。
核酸提取與純化的標(biāo)準(zhǔn)操作程序建議如下：
1、裂解：取離心管，管內(nèi)加入待檢液體樣本100～200ul以及裂解液（Lysis buffer）600ul，輕搖、混勻；
2、吸附：吸附柱內(nèi)加入無(wú)水乙醇300ul和上述裂解液體300ul（上述離心管內(nèi)剩余的裂解樣本可留作備份），1x10^4 rpm，30秒，棄液；
3、洗滌：吸附柱內(nèi)加入600ul清洗液（Wash buffer），1x104rpm，30秒，棄液（重復(fù)此步驟1次）。棄液后，1x10^4 rpm，再次離心3分鐘；
4、收集：換套管，吸附柱內(nèi)加入約50ul洗脫液（Rinse buffer），輕搖、混勻，1x10^4 rpm，30秒，保留濾液，冷凍保存，備用。
若采用該標(biāo)準(zhǔn)程序，基本上可以在10分鐘之內(nèi)完成核酸提取和純化的操作步驟，大大縮短后續(xù)分子生物學(xué)操作的時(shí)間。
核酸提取與純化的未來(lái)發(fā)展方向是：操作簡(jiǎn)單化、試劑環(huán)保化、核酸優(yōu)質(zhì)化。
操作簡(jiǎn)單化：盡量不使用酶類（如蛋白酶K等）成分，提高試劑存放的便捷性；減少操作步驟或?qū)崿F(xiàn)機(jī)器自動(dòng)操作。對(duì)于少量樣本來(lái)說(shuō)，人工提取的效率（得率）要高于機(jī)器提取的效率。
試劑環(huán)保化：避免提取和純化試劑中包含有毒有害的物質(zhì)，尤其是禁止使用揮發(fā)性有毒物質(zhì)（如酚、氯仿、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等），這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人造成身體的傷害。
核酸優(yōu)質(zhì)化：如果提取的核酸用于PCR等反應(yīng)，建議提取總核酸（DNA和RNA），減少分步提取的繁瑣程序，通過(guò)特殊的方法保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性并減少核酸之間的物理纏繞。對(duì)于豬群的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，一次性提取的核酸可以用來(lái)檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、非洲豬瘟、偽狂犬和環(huán)狀病毒以及細(xì)菌感染等，大大減輕檢測(cè)工作的負(fù)擔(dān)。
非洲豬瘟“化”以來(lái)，關(guān)于該病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)內(nèi)容的討論越來(lái)越多，取得的科技進(jìn)展也越來(lái)越大。從樣本的采集、運(yùn)輸、保存到核酸的提取、擴(kuò)增，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)大大降低非洲豬瘟病毒檢測(cè)工作的敏感性。在2018年8月份和2019年3月份之間，這種檢測(cè)敏感性較低的情況尤為突出。
唾液學(xué)檢測(cè)具有較高的生產(chǎn)現(xiàn)實(shí)意義，該方法已經(jīng)成為非洲豬瘟檢測(cè)工作的方法。血液學(xué)檢測(cè)過(guò)渡至唾液學(xué)檢測(cè)的過(guò)程中，同樣也出現(xiàn)了很多的問(wèn)題，這些問(wèn)題正在被逐步解決。
先是唾液中病毒核酸被干擾的問(wèn)題嚴(yán)重影響了唾液學(xué)檢測(cè)技術(shù)的推廣進(jìn)度。唾液中的活性酶會(huì)大大縮短樣本中目標(biāo)核酸的半衰期，導(dǎo)致漏檢率的居高不下，嚴(yán)重影響了定點(diǎn)清除（拔牙式清除）工作的效率。不過(guò)，隨著各個(gè)試劑公司推出唾液樣本保護(hù)液，該問(wèn)題已經(jīng)得到較好的解決。
根據(jù)近期實(shí)驗(yàn)室研究比對(duì)得到的情況，病毒核酸的提取和純化再次成為約束唾液學(xué)檢測(cè)的另外一個(gè)重要瓶頸，這個(gè)問(wèn)題如果不能及時(shí)得到解決將大大阻礙明年春季非洲豬瘟疫情的防控工作。
非洲豬瘟病毒大多數(shù)存在于細(xì)胞之內(nèi)，病毒核酸也被雙層囊膜和多層蛋白質(zhì)緊緊包裹，只有將病毒核酸徹底釋放并純化，才能實(shí)現(xiàn)核酸的有效擴(kuò)增。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作中，尤其是唾液學(xué)檢測(cè)工作中，經(jīng)常性出現(xiàn)漏檢（假陰性）的情況，這些情況大大困擾了生產(chǎn)技術(shù)人員和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員，嚴(yán)重制約了非洲豬瘟的定點(diǎn)清除工作和未來(lái)非洲豬瘟凈化工作的效果。
根據(jù)現(xiàn)代生物技術(shù)研究的進(jìn)展，病毒核酸的提取和純化總體上分成三步：核酸釋放、核酸純化和收集。
各個(gè)試劑公司出品的試劑盒具有相對(duì)的不完備性，往往通過(guò)增加繁瑣的步驟試圖完成核酸的提取和純化工作，但增加提取步驟會(huì)大大降低了核酸的得率。所以，簡(jiǎn)化操作過(guò)程將成為核酸提取和純化研究的要任務(wù)。
核酸釋放：組織細(xì)胞內(nèi)和病原體內(nèi)的核酸釋放可以通過(guò)反復(fù)凍融法、機(jī)械研磨法和化學(xué)裂解法進(jìn)行。無(wú)論采用哪一種方法，內(nèi)源性和外源性核酸酶都會(huì)降低核酸的得率。實(shí)際操作中往往通過(guò)采用較低的溫度條件、快速的機(jī)械研磨或加核酸酶抑制劑等方法避免核酸酶的降解作用。
核酸純化：裂解后的液體中除了含有核酸成分以外，還有大量的雜質(zhì)，如蛋白、多糖以及其它化學(xué)物質(zhì)。這些雜質(zhì)不除去，可能會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的核酸擴(kuò)增。核酸純化的常見(jiàn)方法有酚-氯仿法、膜吸附法和磁珠吸附法。由于使用了有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，酚-氯仿法基本上已經(jīng)被棄用，而采用吸附法純化核酸將成為未來(lái)的主流。
收集：核酸的收集比較簡(jiǎn)單，吸附在膜上或磁珠上的核酸可以用純水洗脫。但是，為了提高核酸得率并保護(hù)核酸，可以用特殊的溶液進(jìn)行洗脫。
EDTA會(huì)抑制后續(xù)的分子生物學(xué)反應(yīng)，不建議使用TE進(jìn)行核酸洗脫。
核酸提取與純化（柱提法）的商品化套裝應(yīng)該包括：裂解液1瓶（建議使用棕色瓶，裂解液中要求包含助吸附成分（Binding buffer），減少操作步驟），清洗液1瓶（建議使用白色瓶，使用前加入適量無(wú)水乙醇或異丙醇），洗脫液1瓶，吸附柱（若干），簡(jiǎn)易說(shuō)明書（1份）。
核酸提取與純化的標(biāo)準(zhǔn)操作程序建議如下：
1、裂解：取離心管，管內(nèi)加入待檢液體樣本100～200ul以及裂解液（Lysis buffer）600ul，輕搖、混勻；
2、吸附：吸附柱內(nèi)加入無(wú)水乙醇300ul和上述裂解液體300ul（上述離心管內(nèi)剩余的裂解樣本可留作備份），1x10^4 rpm，30秒，棄液；
3、洗滌：吸附柱內(nèi)加入600ul清洗液（Wash buffer），1x104rpm，30秒，棄液（重復(fù)此步驟1次）。棄液后，1x10^4 rpm，再次離心3分鐘；
4、收集：換套管，吸附柱內(nèi)加入約50ul洗脫液（Rinse buffer），輕搖、混勻，1x10^4 rpm，30秒，保留濾液，冷凍保存，備用。
若采用該標(biāo)準(zhǔn)程序，基本上可以在10分鐘之內(nèi)完成核酸提取和純化的操作步驟，大大縮短后續(xù)分子生物學(xué)操作的時(shí)間。
核酸提取與純化的未來(lái)發(fā)展方向是：操作簡(jiǎn)單化、試劑環(huán)保化、核酸優(yōu)質(zhì)化。
操作簡(jiǎn)單化：盡量不使用酶類（如蛋白酶K等）成分，提高試劑存放的便捷性；減少操作步驟或?qū)崿F(xiàn)機(jī)器自動(dòng)操作。對(duì)于少量樣本來(lái)說(shuō)，人工提取的效率（得率）要高于機(jī)器提取的效率。
試劑環(huán)保化：避免提取和純化試劑中包含有毒有害的物質(zhì)，尤其是禁止使用揮發(fā)性有毒物質(zhì)（如酚、氯仿、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等），這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人造成身體的傷害。
核酸優(yōu)質(zhì)化：如果提取的核酸用于PCR等反應(yīng)，建議提取總核酸（DNA和RNA），減少分步提取的繁瑣程序，通過(guò)特殊的方法保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性并減少核酸之間的物理纏繞。對(duì)于豬群的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，一次性提取的核酸可以用來(lái)檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、非洲豬瘟、偽狂犬和環(huán)狀病毒以及細(xì)菌感染等，大大減輕檢測(cè)工作的負(fù)擔(dān)。
綜上所述，豬群病原的核酸檢測(cè)工作研究任重道遠(yuǎn)，值得進(jìn)一步深入探索。
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